實(shí)驗(yàn)方法原理
從瓊脂糖凝膠回收 DNA 是通過電泳至帶正電荷的 DEAE-纖維素膜上完成的。這種方法首先利用適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠電泳分離 DNA 片段，然后緊靠目的 DNA 片段條帶前方切一裂縫。將一長(zhǎng)條 DEAE 纖維素膜插入裂縫。
實(shí)驗(yàn)材料
限制性內(nèi)切核酸酶DNA 樣品DNA 標(biāo)準(zhǔn)RNA
試劑、試劑盒 乙酸銨DEAE 高鹽洗脫緩沖液DEAE 低鹽洗脫緩沖液EDTA 乙醇凝膠載樣緩沖液NaOH酚氯/仿醋酸鈉TE
儀器、耗材 瓊脂糖凝膠DEAE 纖維素膜手提式長(zhǎng)波紫外燈水浴
實(shí)驗(yàn)步驟
一、材料
1. 緩沖液和溶液
乙酸銨（10 mol/L)
DEAE 高鹽洗脫緩沖液（50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)，1 mol/L NaCI，10 mmol/L EDTA (pH 8.0)）
DEAE 低鹽洗脫緩沖液（50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)，0.15 mol/L NaCl，10 mmol/L EDTA (pH 8.0)）
EDTA ( 10 mmol/L，pH 8.0)
乙醇
6X 凝膠載樣緩沖液
0.5 mol/L NaOH
酚: 氯/仿（1:1，V/V)
醋酸鈉（3 mol/L，pH 5.2)
TE ( pH 8.0)
2. 酶和緩沖液
限制性內(nèi)切核酸酶
3. 凝膠
瓊脂糖凝膠，含有 0.5 μg/ml 的 EB
4. 核酸和寡聚核苷酸
DNA 樣品
DNA 標(biāo)準(zhǔn)
RNA，酵母轉(zhuǎn)運(yùn) tRNA
5. 專用設(shè)備
DEAE 纖維素膜
手提式長(zhǎng)波紫外燈
65℃ 水浴
二、方法
1. 消化一定量 DNA 以收獲至少 100 ng 目的片段 DNA。用含有 0.5 μg/ml EB 的適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠電泳分離 DNA 片段。用手提式長(zhǎng)波紫外燈對(duì)目的條帶進(jìn)行定位。
2. 用鋒利的刀片或剃刀在緊靠目的條帶前的凝膠上切一切口，其兩邊比條帶寬約 2 mm。
3. 戴上手套，切一塊與切口等寬而比凝膠稍深（1 mm ) 的 DEAE 纖維素膜。在 10 mmol/L EDTA ( pH 8.0) 室溫浸泡 5 min 后，用 0.5 mol/L NaOH 取代 EDTA 浸泡以活化 DEAE 纖維素膜。再次室溫 5 min 后，用無(wú)菌水沖洗 6 次。
4. 用平頭鑷子將切口壁撐開，將膜插入裂縫中。取出鑷子，使切口閉合，小心勿留氣泡。
5. 繼續(xù)電泳（<5 V/cm) 直至 DNA 條帶遷移到膜上。電泳過程中，可以用手提式長(zhǎng)波紫外燈（302 nm ) 進(jìn)行跟蹤檢測(cè)。
6. 當(dāng)所有目的 DNA 離開凝膠被收集到膜上時(shí)，切斷電流。用平頭鑷子從凝膠中取出膜，室溫下，用 5~10 ml DEAE 低鹽緩沖液將膜漂洗一下，以除去膜上的瓊脂糖。
7. 將膜轉(zhuǎn)移到另一個(gè)微量離心管中，加足量的 DEAE 高鹽洗脫緩沖液使膜wan全被浸沒。輕輕的將膜弄皺或?qū)φ?，但不要壓緊。蓋上離心管蓋，于 65℃ 溫育 30 min。
8. 從膜上洗脫 DNA 的過程中，對(duì)凝膠成像，記錄被分離出的條帶。
9. 步驟 7 的液體轉(zhuǎn)移到另一微量離心管，再加入足量的 DEAE 高鹽洗脫緩沖液，于 65℃ 溫育 15 min。合并兩份 DEAE 高鹽溶液。
10. 高鹽洗脫液用酚：氯/仿抽提一次。水相轉(zhuǎn)移到另一離心管。加入 0.2 倍體積的 10 mol/L 乙酸銨，2 倍體積的 4℃ 乙醇。室溫放置 10 min。用微量離心機(jī)室溫以最大轉(zhuǎn)速離心 10 min。用 70% 乙醇小心洗沉淀。打開離心管幾分鐘，使乙醇wan全揮發(fā)。再將 DNA 重溶到 3~5 μl TE (pH 8.0)。
11. 如果需要極純的 DNA ( 如用于小鼠受精卵的顯微注射或培養(yǎng)細(xì)胞電穿孔)，可以按照下述方法用乙醇再沉淀 DNA。
(1) 用 200 μl TE（pH 8.0）懸浮 DNA，
加入 25 μl 3 mol/L 乙酸鈉（pH 5.2），用 2 倍體積的乙醇重新沉淀 DNA。
(2) 4℃ 微量離心機(jī)最大速度離心 5~15 min, 回收 DNA。
(3) 70% 乙醇小心漂洗沉淀。打開離心管幾分鐘，使乙醇wan全揮發(fā)。將 DNA 溶于 3~5 μl TE ( pH 8.0)。
12. 通過凝膠電泳對(duì) DNA 進(jìn)行定性和定量。將少量（10~50 ng) 最終制備的 DNA 片段與 10 μl TE ( pH 8.0) 混合，加入 2 μl 所需的凝膠載樣緩沖液。加樣并在適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，以已知量的經(jīng)用適當(dāng)限制酶消化的原 DNA 作為參照物標(biāo)準(zhǔn)和分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。分離的片段應(yīng)該與限制酶消化產(chǎn)物中的相應(yīng)片段同步遷移。仔細(xì)檢査凝膠，看是否有弱熒光帶存在。弱熒光帶存在表明有DNA污染。
 |
 |
 |
